분자 진단이란 무엇인가?
사람이나 동물로부터 혈액, 조직, 침, 콧물, 분변 등의 시료를 채취하여 검사 목적에 따라 체외에서 신속하게 진단해내는 기술 분야를 체외진단이라고 하며, 면역 화학적 진단, 자가 혈당 측정, 현장진단, 분자진단 기술이 핵심 기술 분야라고 할 수 있다.
최근의 급격한 기술 발전을 보았을 때, 임상화학 분야와 면역학 분야가 융합되어, 기계 장비류를 이용한 첨단 진단 기술들이 하루가 다르게 발전되고 있다. 수의분야에서는 반려동물을 중심으로 한 동물병원에서는 이러한 기계, 장비류에 의한 진단을 지속적으로 적용해오고 있지만, 산업동물은 아직, 면역학적 진단법이나 유전학적 진단법에 따른 감염병 진단에 집중되고 있는 실정이다.
과거, 수의 영역 중, 감염병 분야의 진단은, 임상 증상에 기반을 둔 수의사의 경험적 판단에 따라 이루어졌으나 과학의 발달로 감염병의 원인이 되는 바이러스와 세균에 대한 배양법이 알려지면서 원인체를 동정할 수 있게 되었고, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)나 Rapid kit(pen-side kit, Immunochromatography kit, Lateral Flow Test) 기반 기술을 이용하여 항원, 항체 수준의 검사를 할 수 있게 되었으며, 최근에는 Real-time PCR(Polymerase Chain Reaction) 기술을 이용하여 타겟 유전체 1~10 copy 단위의 극소량의 시료도 검출해내는 높은 민감도의 정확한 진단을 실행할 수 있게 되었다.
동물용 감염병 체외진단의 경우 그 대상에 따라 산업동물용과 반려동물용으로 구분되고, 기술적 분류에 따라 크게 현장에서 즉시 검사하여 결과를 확인할 수 있는 Rapid kit, 항원-항체 반응을 이용한 ELISA와 같은 면역학적 진단, 사람이나 동물 또는 감염병 원인체의 유전정보가 담긴 핵산(RNA, DNA)을 이용하여 질병 감염 여부나 병적인 상태를 구분할 수 있게 하는 분자진단(PCR) 등으로 나눌 수 있다(표 1).
특히, 분자진단은 진단검사의학에 분자유전학의 지식과 기술들을 가져온 것으로서, 완벽한 재현성과 빠른 결과도출이 가능하며, 정량이 가능해 예후 진단이나 다양한 감염병 확진에 사용되며, 적은 양의 시료로 여러 종류의 질병을 동시에 진단하는 것이 가능하다.
분자진단은 감염성 질환 검사, 종양 검사, 유전질환 검사 등 다방면으로 활용되고 있으며(표 2), 체외진단 분야에서 가장 민감하고 특이도, 정확도가 높아 그 중요성이 커지고 있다. 인체 분야에서는 감염성 질환뿐만 아니라, 유전질환 검사 등에도 이용되어 정밀의료(환자 특성에 맞게 제공되는 맞춤형 의료서비스)에 이용되지만, 동물 분야에서는 감염성 질환에 초점이 맞추어져 있어, 핵산 증폭 방법이 주로 이용되고 있다.
분자 진단의 대표기술
PCR 기술은 주형이 되는 DNA 혹은 RNA로부터 Taq polymerase를 이용하여 원하는 타겟 유전자만을 연속하여 증폭시키는 기술로, 민감도가 좋아 소량의 핵산에 대해서도 검출할 수 있다. 분자진단의 대표적인 기술 분야는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 유전자 염기서열검사(sequencing), 마이크로 어레이(Microarray)가 있다.
그중 가장 많이 사용하고 민감도가 우수한 기술인 PCR은 Conventional PCR(1세대), Real-time PCR(2세대), Digital PCR(3세대)로 나눌 수 있다(표 3). Conventional PCR이란 효소를 이용하여 DNA 및 RNA의 특정 영역을 증폭시켜 반응이 끝난 후 결과물을 눈으로 확인하는 방식으로, 증폭된 타겟 유전자를 확인하기 위해 전기영동과 같은 2차 과정이 필요하다.
Real-time PCR은 타겟 유전자의 증폭을 실시간으로 분석이 가능하고, 타겟 유전자에 대한 정량도 가능하여 qPCR(quantitative PCR)이라고도 부른다. Real-time PCR은 결과 분석 시 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, PCR product를 직접 다루지 않고 타겟 유전자 증폭에 따른 형광량의 변화를 가지고 분석하기 때문에 2차 오염의 위험성이 적다. 또한, 최근 나오는 대부분이 장비가 4~5개의 형광 채널을 가지고 있어 4개 이상의 타겟 유전자를 동시 감별할 수 있는 multiplex PCR이 가능해 분자진단 기술 중 가장 많이 사용되며 폭넓게 활용되고 있다.
마지막으로 Conventional PCR과 Real-time PCR이 반응 용액을 하나의 tube에서 진행하였다면, digital PCR은 하나의 반응 용액을 수만 개의 미세방울로 나누어 반응시켜 타겟 DNA의 증폭 여부에 따라, positive droplet(1로 표현)과 negative droplet(0으로 표현)으로 digital signal처럼 받아들여 계수하고, Poisson 분포를 통해 타겟 DNA를 계산해 최종적으로 copy수로 결과를 확인하는 것이다. 이러한 Digital PCR은 농도가 현저히 다른 중복 감염병원체에 대해서도 검사가 가능하며, 정상 유전자 속에서 희귀대립유전자(돌연변이) 검출, 유전자 변이에 의한 질병 연구, 병원체의 돌연변이주 검출 등에 유용하게 쓰이고 있다.
유전자 염기서열 검사(sequencing)는 1975년 F. Sanger 등이 개발한 dideoxy chain-termination 원리의 효소반응법이 보편적으로 이용되고 있으며, 현재는 이 Sanger 방법을 바탕으로 형광 표지자와 모세관 전기영동 기반의 자동화된 염기서열 검사기기가 일반화되어 있다.
최근에는 유전체 전체의 염기서열을 동시에 분석하는 전장유전체 염기서열 검사(whole genome sequencing)의 기법들이 계속 개발되고 있으며, 염기서열의 변이가 원인인 유전질환에서는 그 유전자에 대한 염기서열 검사를 시행하여, 유전자 돌연변이를 찾아내는 데 이용되고 있다.
마이크로 어레이(Microarray)는 핵산의 부합(hybridization) 원리를 기본으로 수천, 수만 개의 유전자를 한꺼번에 분석할 수 있는 기술로 작은 슬라이드 위에 수많은 합성 DNA 조각(탐색자)을 미세하게 집적시킨 것을 DNA chip이라고 하며, 분석하고자 하는 환자 검체의 DNA 조각을 형광으로 표지한 후 DNA chip에 반응시키면 상보적인 염기순서의 탐색자와 부합이 이루어지고 이를 형광 레이저 스캐너를 이용해 분석하는 것이다.
이 진단법은 산업동물의 CSFV, PRRSV, PCV2에 대한 동물 질병 진단에도 주로 이용된다(그림 1).
예를 들어, CSFV는 3가지 유전형이 존재하고, 특히 약독화 LOM주 생백신을 사용하고 있으므로 CSFV 양성 확인을 포함하여 백신주사 유무 및 야외주의 유전형을 시퀀싱 레벨 수준의 정보로 확인하여야 하는데 CSFV DNA chip은 이런 정보를 동시에 수 시간 내에 확인할 수 있기 때문에 유용하게 쓰이고 있다.
동물용 분자 진단의 현재와 전망
2014년 기준으로 전 세계 산업동물 체외진단 시장의 규모는 약 100억 달러이며, 반려동물 체외진단시장 규모는 약 175억 달러로 꾸준한 증가하는 양상을 보이며, 2019년에는 동물용 체외진단 시장의 규모가 전체 350억 달러에 이를 것으로 전망하고 있다(출처: Kalorama information, 2014).
이중 분자진단 분야가 차지하는 비중은 2014년 기준으로 17% 정도인 300억 달러이며 정확한 진단이 가능하다는 강점으로 수요가 꾸준히 증가하고 있어 향후 가장 높은 연평균 성장률이 예상되는 분야이다. 국내의 경우에는 2017년 기준으로 40억 원의 시장을 형성하고 있으며(출처: 농림축산검역본부), 전체 국내 동물용 체외진단 시장인 1000억 원의 4% 정도로 아직은 세계 시장의 평균적인 점유율에도 못 미치고 있다. 그러나 진단 시장에서, 꾸준히 고감도의 Real-time PCR 검사 시장이 증가하고 있고, Rapid 제품보다 고감도 검사를 요구하고 있기 때문에, 시장규모가 지속적으로 증가할 것으로 예상된다.
분자진단은 크게, PCR machine을 연구, 공급하는 제조회사와 시약을 전문적으로 하는 제조회사로 나눌 수 있으며, 국내의 경우에는, 4개 회사에서, 주로 시약을 전문적으로 연구 개발하여, 산업동물용 PCR 키트들을 제조하고 있는 실정이다. 반려동물용 분자진단 시장은 거의 전무하며, 실험실적 수준에서 in house 형태로 자가 제조하여 진단이 수행되고 있다.
동물용 분자진단 분야는 대상 동물에 따라 진단의 목적에 차이가 있으며, 산업동물의 경우 감염병의 조기진단 및 사전예방에 중점을 두기 때문에 병원체의 확진이나 병원체의 돌연변이 발생 여부에 대한 확인이 주요 개발목적이 되고 있다.
최근 one health 개념의 확산으로 인간만이 중심이 아니라 인간과 동물 그리고 자연 모두의 건강하고 조화로운 공존이 중요시되는 사회에서 인수공통전염병에 대한 관심도 매우 증가하고 있으며 분자진단 시장에서도 인수공통전염병 진단 시장이 점차 확대되고 있는 추세이다.
반려동물에 대한 분자진단 시장은 사람과 유사하게 질병의 진단과 치료에 초점이 맞춰지기 때문에 주로 감염성 질병의 원인체 분석과 암이나 유전질환 같은 비감염성 질병의 진단에 그 개발목적이 있다.
PCR 제품의 유통 측면에서는, 제품 특성상, 냉동 유통이 되어야 하므로, 국제적인 수출입에는 일정 부분 제약 요건이 있다. 따라서 향후에는 냉장 혹은 실온 상태로도 유통될 수 있는 시약 개발이 시급한 상황이다.
POCT PCR의 전망
분자진단 기술 변화의 핵심은 첫째 고효율의 신속한 결과, 우수한 민감도, 정확한 특이도가 바탕이 되어 왔으며, 둘째 사용자 편의성 증진 및 다중진단을 위한 융복합형 자동화 기기로 개발되어 왔다. 체외진단 분야에서 PCR은 제일 높은 민감도와 정확도를 보여주지만, 휴대가 어려워 현장진단이 어렵다는 한계를 가지고 있다.
소형화 자동화 등을 통해 휴대성을 높여 현장 진단분야에서 활용 가능하게 된다면, 발생한 지점으로부터 검체가 실험실로 운반되는 중 시료의 변질로 인한 위음성이나, 시료 간 오염으로 인한 위양성 등 부정확한 결과가 도출되는 것을 막고, 시료의 이동 및 검사 전까지 소모되는 시간을 줄여 현장에서 이뤄지는 신속하고 정확한 확진 결과를 얻을 수 있고, 이에 따른 농장의 격리 및 이동제한 등의 조치를 통해 전염병의 확산을 막고 질병을 조기에 통제할 수 있는 체계를 갖추게 될 것이다.
현재의 조류 인플루엔자 방역체계는, 의심 신고가 접수되었을 때, 방역관이 방문해서, 여러 가지 임상조사와 Rapid kit를 활용하여, 1차적인 진단을 내리고, 이후 방역기관에서 PCR과 유전자 분석을 통하여 확진하는 시스템이다. 이러한 시스템에서, Rapid kit만큼 신속한 진단이 가능하면서, Rapid kit의 단점인 높은 위음성률을 PCR이 대신해 줄 수 있다면, 획기적으로 방역체계가 개선될 것으로 전망된다.
즉, 국가 재난형 질병인 구제역이나 고병원성 인플루엔자 등 고위험성 전염병의 경우, 실험실 정밀검사 외에 현장에서 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 분자진단 기술이 요구되고 있다. 이를 만족시킬 PCR이 지속적으로 연구돼 오고 있었으며, 이를 현장검사용 POCT PCR(point of care testing PCR)이라고 한다(그림 2).
개념적으로, 핵산 추출 단계, Premix 혼합 단계, PCR 단계로 나눌 수 있으며, 각 단계들이 빠른 시간 내에, 자동화되는 것을 최종 목표라고 할 수 있다.
POCT PCR은 실제적으로,
1) 신속성; 유전자 추출부터 결과값 도출까지 30분 이내면 가장 좋을 것으로 보이며,
2) 정확성; 결과값도 실험실 결과값과 같아야 하며,
3) 휴대성; 휴대가 가능할 정도로 PCR machine의 무게가 가벼워야 하고,
4) Multiplex; 한 tube 내에서 여러 개의 타겟 유전자가 검출될 수 있게 여러 개의 형광 표지자가 함유되어야 하며,
5) 편리성; 농장 현장의 오염된 환경하에서도 실험이 가능하도록 해야 하며,
6) 자동화; 검체 투입만 하면 결과값이 나오도록 자동화되는 것이 좋으며,
7) 저렴한 가격; 국가 방역 정책에 잘 활용되도록 가격적인 부분이 고려되어야 하고,
8) 무선통신; 무선 인터넷을 통하여 중앙 컨트롤 타워로 결과값이 바로 전송되어, 상황파악이 신속히 되도록 하여야 하며,
9) 소독 가능; PCR 진단 장비들을 타 농장이나 지역으로 옮길 때, 전염병의 전파 요인이 될 수 있으므로, 전체를 소독할 수 있는 시스템이 부수적으로 장착되어야 한다(표 4).
이러한 여러 가지 조건들을 만족시켜야 만이, 동물 유래의 국가 재난형 질병 컨트롤에 실제적으로 응용될 수 있을 것이다.
반려동물을 위한 동물병원에서도, POCT PCR의 활용도는 매우 높을 것으로 보인다.
개나 고양이의 반려동물 감염병은 주로 Rapid kit가 이용되고 있지만, multiplex가 가능하고, 신속성이 있다면, 현재의 Rapid kit 시장을 대체할 수 있을 것으로 추정된다.
특히, 진단 키트가 많이 없는 고양이 질병에서 매우 유용하게 수의사의 진단에 도움을 줄 것으로 예상된다. 호흡기질병 원인체, 혹은 소화기 질병 원인체를 multiplex 형태로 키트를 제조한다면, 1회 검사로 확진을 내릴 수 있는 장점이 있을 수 있다.
POCT PCR은 저개발 국가나 혹은 섬들이 많아서, 중앙 집중적인 진단 시스템이 불가능한 원거리 지역 혹은 고립 지역에서도 매우 유용한 진단 방법이 될 수 있다. 그러나 아직까지 이러한 조건들을 완전히 만족시킬 만한 제품들이 개발되지 않았고, 빠른 시간 내의 핵산 추출 문제, RNA 바이러스의 신속한 cDNA 합성문제, 빠른 PCR을 위한 enzyme 선택 문제, 신속한 PCR이 되기 위한 PCR machine의 설계 등 난관들이 많이 존재한다.
그렇지만, 수년 내에 충분히 상용화될 것이라 생각되며, 분자진단의 새로운 이정표를 만들 것으로 기대된다. 가장 근접하게 개발된 제품들은, 인의용으로 미국 FDA에 승인된 제품으로서, Alere사의 iNAT Flu A/B, Cepheid사의 Xpert Flu Assay, IQuum사의 Liat Influenza A/B Assay 등이 있지만, 가격 측면 혹은 휴대성 측면에서 단점들을 가지고 있다. 국내에서도, 바이오니아, 나노바이오시스, 아람바이오시스템 등의 회사가 개발 중이다.
동물용 분자진단 영역에서의 수의사의 역할
수의학 특히 산업동물 분야의 수의학은 치료보다 예방수의학에 초점이 맞춰져 있으며, 예방에 있어 키워드는 바로 빠르고 정확한 진단이다. 감염병 발생 시 빠른 격리 및 질병 확산 예방을 위해 감염병 원인체에 대한 분자진단 분야의 기술은 꾸준히 발전하고 있으며 분자진단의 특징인 민감하고 정확한 진단결과와 휴대성의 증가로 체외진단시장에서 분자진단이 차지하는 비율은 점차 증가하는 추세이다.
또한, 반려동물을 키우는 가정의 증가와 반려동물을 대하는 인식의 변화로 감염병 진단뿐 아니라 질병이나 암 진단을 위한 분자진단 분야도 앞으로 크게 각광을 받을 것으로 예상되어진다.
정확한 분자진단을 하기 위해서는 정성과 비정상, 병원체 음성과 양성 등을 구별해낼 수 있는 독특한 표지자들인 바이오 마커들이 필수적이다.
특히 수의사는 학위 과정 중에 미생물학, 병리학, 임상병리학 등의 다양한 과목의 학습을 통해서 질병에 대한 이해도가 매우 높아, 분자진단을 활용하여 임상적으로 진단을 활용한 예방 및 치료에 대한 적절한 적용이 가능하다.
예를 들어 감염병 대응을 위해서는 정확한 진단, 예방, 치료로 3개의 전략을 들 수 있으며, 그중에서도 정확한 진단은 효과적인 감염병 대응을 위해 필수적이다. 감염병 진단을 위한 분자진단의 적용에 있어, 수의사들은 분자 진단결과를 일차원적으로만 해석하여 바로 판정을 내리는 것이 아니라, 감염병의 발병 후 각 병기(stage)에서 진단결과의 의미를 파악하는 데 탁월하며, 감염병 진단결과를 임상 증상과 연계하고 진단결과를 빠르게 백신과 같은 예방법과 치료를 위한 처방에 응용하는데 매우 훈련이 잘되어 있다고 할 수 있다.
위와 같이 수의사는 누구보다도 동물의 질병에 대한 이해도가 높고 질병의 전체 진행단계를 명확히 알고 있으므로 임상적으로 유효한 진단 마커들을 찾아내는데 중심적 역할을 해줄 수 있을 것으로 기대하며, 질병을 가장 잘 아는 수의사만이 할 수 있는 질병 감별 진단 분야는 향후에도 매우 전망이 밝다고 할 수 있다. 따라서 동물용 분자진단의 발전을 위해 수의사들의 적극적 참여와 관심이 필요하다.
참고문헌
1. 2017 체외진단기기 시장동향과 기술개발. pp. 190-194. CHO Alliance. 2017.
2. 김소연: 분자진단 기술을 이용한 POCT Real-time PCR 개발 제안서. 충북대학교 대학원. 2016.
3. Frost & Sullivan Online Store: Analysis of the global in vitro diagnostics market. 2014.
*이 글은 대한수의학회 60년사 제3장 ‘수의학 미래 60년을 전망하다’에 담긴 내용입니다. 이흥식 대한수의학회 60년사 편집위원장님의 도움으로, 60년사 제3장에 담긴 글 10개를 데일리벳에 게재합니다.
수의학회 창립 60주년은 미래 수의학 60년을 준비하는 시작점이라는 견지에서 현재 그리고 미래에 주목이 되는 주제를 중진 학자의 추천을 받아 선정하고, 이 주제와 수의학과 수의사는 어떻게 관련되며, 이들의 국내·외 현황과 전망은 어떠하며 그리고 이 분야에서 수의학과 수의사가 할 수 있는 역할은 과연 무엇이고 앞으로 어떻게 대처하는 것이 최선인지를 알아보는 글을 펴내기로 하였습니다. 그리고 이에 관한 집필자는 원로 학자나 신진 학자보다 당해 분야의 중견 학자와 벤처 기업 CEO가 현실을 직시하며 당해 분야에서 중추적인 역할을 충실히 하고 있다는 점에서 적합한 저자를 추천받아 원고를 청탁하고 이들의 글을 게재하기로 수의학회 60년사 편집위원회에서 결정하였습니다.
1. 유전자 조절 연구와 수의사의 역할 _ 서울대 교수 한호재
2. 수의학 분야에서의 분자진단의 현황과 전망 _ ㈜메디안디노스틱 대표 오진식
3. 수의임상에 미치는 4차 산업혁명의 전망 _ 전북대 교수 김남수
4. 국내 동물복지 현황, 전망 및 수의사의 역할 _ 건국대 교수 한진수
5. 국가방역체계의 현황과 전망 및 수의학의 역할 _ 농림축산검역본부 부장 정석찬
6. 급성장하는 반려동물 시장과 수의사 _ ㈜마미닥터 수석연구원 이미진
7. 동물용의약품 시장 전망 및 신약개발 현황 _ 바이엘 코리아㈜ 동물의약사업부 대표 정현진
8. 기후변화에 따른 질병 발생 전망과 수의학의 역할 _ 서울대 교수 채준석
9. 줄기세포치료의 현황과 전망 및 수의학에서의 대응방안 _ 서울대 교수 강경선
10. 동물 복제의 역사와 인류역사에서의 의의 _ 충남대 교수 김민규
